EcoRI
EcoRI (wym. [eko er jeden]) – endonukleaza wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu RY13 pałeczki okrężnicy[1], będąca częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych, w biologii molekularnej używana jako enzym restrykcyjny.
Przy cięciu DNA EcoRI tworzy końce lepkie[2] z przedłużonymi końcami 5′. Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromowa sekwencja 5'-G▼AATTC-3' (nić komplementarna 3'-CTTAA▲G-5')[3].
Struktura[edytuj | edytuj kod]
Struktura przestrzenna enzymu została określona metodami rentgenograficznymi w 1986 roku[4].
Struktura pierwszorzędowa[edytuj | edytuj kod]
EcoRI zawiera motyw PD..D/EXK, który jest miejscem aktywnym całej rodziny enzymów restrykcyjnych[5]. W EcoRI motyw ten zawiera reszty P90, D91, E111, A112, K113(2).
Struktura trzeciorzędowa i czwartorzędowa[edytuj | edytuj kod]
Enzym składa się z jednej globularnej domeny z typowymi motywami α i β. Zawiera też wystającą na zewnątrz pętlę, która owija się wokół DNA podczas jego wiązania.
Badania krystalograficzne ujawniły, że formą enzymu jest homodimer. Podczas wiązania DNA obie jednostki oddziałują z nim symetrycznie. Wiązanie realizowane jest przez dwie helisy alfa każdego monomeru, które formują czterohelisowy pęczek[6][7]. Za bezpośrednie współdziałanie obu homodimerów odpowiedzialne są obecne w helisach reszty E144 i R145[8].
Zastosowania[edytuj | edytuj kod]
Z powodu swojej selektywności i swoistego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (zobacz też: ligaza), enzym ten jest stosowany w biologii molekularnej, szczególnie w technikach klonowania, screeningów DNA oraz mutagenezy ukierunkowanej. Enzym wykazuje aktywność star przy podwyższonym pH i zbyt niskiej sile jonowej oraz podwyższonym stężeniu glicerolu[9] (przy podwyższonym stężeniu glicerolu silniej niż przy podwyższonym pH[10]).
Przypisy[edytuj | edytuj kod]
- ↑ D. Roulland-Dussoix, H.W. Boyer. The Escherichia coli B restriction endonuclease. „Biochim Biophys Acta”. 19; 195. 1, s. 219–29, listopad 1970. PMID: 4901831.
- ↑ J.E. Mertz, R.W. Davis. Cleavage of DNA by R 1 restriction endonuclease generates cohesive ends. „Proc Natl Acad Sci USA”. 11 (69), s. 3370–4, listopad 1973. PMID: 4343968.
- ↑ A. Dugaiczyk, J. Hedgpeth, H.W. Boyer, H.M. Goodman. Physical identity of the SV40 deoxyribonucleic acid sequence recognized by the Eco RI restriction endonuclease and modification methylase. „Biochemistry”. 29; 13. 3, s. 503–12, styczeń 1974. PMID: 4358949.
- ↑ J.A. McClarin, C.A. Frederick, B.C. Wang, P. Greene, H.W. Boyer, J. Grable, J.M. Rosenberg. Structure of the DNA-Eco RI endonuclease recognition complex at 3 A resolution. „Science”. 19; 234. 4783, s. 1526–41, grudzień 1987. PMID: 3024321.
- ↑ A. Pingoud, M. Fuxreiter, V. Pingoud, W. Wende. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. „Cell Mol Life Sci”. 6 (62), s. 685–707, marzec 2005. DOI: 10.1007/s00018-004-4513-1. PMID: 15770420.
- ↑ J. Heitman. How the EcoRI endonuclease recognizes and cleaves DNA. „Bioessays”. 7 (14), s. 445–54, lipiec 1992. DOI: 10.1002/bies.950140704. PMID: 1445286.
- ↑ Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. „Nucleic acids research”. 18 (29), s. 3705–27, wrzesień 2001. PMID: 11557805.
- ↑ M.R. Kurpiewski, L.E. Engler, L.A. Woźniak, A. Kobylańska, M. Koziołkiewicz, W.J. Stec, L. Jen-Jacobson. Mechanisms of coupling between DNA recognition specificity and catalysis in EcoRI endonuclease. „Structure”. 10 (12), s. 1775–88, październik 2004. DOI: 10.1016/j.str.2004.07.016. PMID: 15458627.
- ↑ B. Polisky, P. Greene, D.E. Garfin, B.J. McCarthy, H.M. Goodman, H.W. Boyer. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease. „Proc Natl Acad Sci USA”. 9 (72), s. 3310–4, wrzesień 1976. PMID: 242001.
- ↑ J. George, R.W. Blakesley, J.G. Chirikjian. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521–4, 1980. PMID: 6248525.